Trong tự nhiên, các virus bám vào tế bào và bơm vật chất di truyền vào trong tế bào. Trong phòng thí nghiệm, các nhà khoa học đã lợi dụng quá trình này. Họ tìm cách lấy đoạn gen của virus vô hại hoặc giảm độc lực và chèn thêm đoạn vật chất di truyền của vi sinh vật khác. Virus đóng vai trò vận chuyển DNA tới các tế bào. Vắc – xin tái tổ hợp bắt chước nhiễm trùng tự nhiên và vì vậy làm tốt công việc kích thích hệ miễn dịch . Vi khuẩn giảm độc lực cũng có thể được sử dụng làm vector, tuy nhiên không phổ biến bằng cách sử dụng virus. Trong trường hợp này, vật chất di truyền chèn vào làm vi khuẩn biểu lộ kháng nguyên của vi sinh vật khác trên bề mặt của chúng. Nhờ vậy, vi khuẩn vô hại bắt chước vi sinh vật gây hại và kích thích đáp ứng miễn dịch.

Tái tổ hợp là khi các gen liên kết không hoàn toàn, xuất hiện các dạng giao tử mới không giống cha mẹ do có sự sắp xếp lại các gen. Hiện tượng này gọi là tái tổ hợp và các dạng mới xuất hiện gọi là dạng tái tổ hợp .

  • Chọn nguyên liệu:

Các loại DNA sử dụng làm phương tiện vận chuyển gen (vector) thường là DNA plasmid hoặc DNA phage. Chúng được thu nhận chủ yếu từ tế bào của vi sinh vật, sau đó sẽ được tách, làm sạch theo phương pháp chiết tách DNA plasmid hoặc DNA virus. DNA chứa gen cần nghiên cứu (DNA lạ) cũng được thu nhận từ tế bào sinh vật được chiết tách, làm sạch và kiểm tra theo phương pháp chiết tách DNA. Ngoài ra, một loại DNA khác có thể sử dụng là DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học, hoặc tổng hợp từ mRNA bằng enzyme sao chép ngược theo cơ chế nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler – Hoffman. Các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau gồm enzyme restriction, enzyme ligase, cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase và alkaline phosphotase,…

  • Công đoạn cắt với sự tham gia của enzyme RE (Restriction Endonuclease) kiểu II:

RE kiểu II là những enzyme cắt hạn chế ở những vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một số ưu điểm: hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg và không cần năng lượng ATP. Các enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA sẽ cắt DNA thành hai mảnh dạng đầu bằng hay đầu dính. Hiệu quả cắt của enzyme giới hạn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như hàm lượng của enzyme, nhiệt độ, ion kim loại, môi trường đệm, pH và độ tinh khiết của DNA.

  • Công đoạn nối với sự tham gia của DNA ligase:

Bước tiếp theo của kĩ thuật di truyền là nối các đoạn DNA vào vector chuyển gen để tạo thành plasmid có mang DNA lạ. Phản ứng nối được thực hiện bằng cách sử dụng enzyme DNA ligase. DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng cạnh nhau. Trong sinh học phân tử, DNA ligase được coi như là một chất keo phân tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau. Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau. Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp, nên để tăng hiệu suất phản ứng, thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA. Với trường hợp nối đầu lệch, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ sung nên chúng tiến gần lại nhau để tạo liên kết hydro giữa các nitrogen base bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai đầu nối tạo liên kết ester giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA ligase.

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here